一、scHi-C 核心原理概述

scHi-C（single-cell High-throughput Chromosome Conformation Capture）是单细胞水平的染色质三维空间互作捕获技术，核心目标是解析单个细胞内染色质的多位点同时互作（Chromatin Hub）。 其实验核心原理：通过甲醛交联固定染色质天然空间构象，限制性内切酶切割基因组DNA，对空间邻近的不同染色质区段进行生物素标记与连接，形成跨多个基因组位点的嵌合DNA片段；利用高通量双端测序读取嵌合片段序列，通过生物信息学比对定位片段对应的基因组坐标，最终还原染色质的真实空间接触关系。 区别于群体细胞Hi-C，scHi-C 高度依赖**嵌合read（chimeric read）**的捕获与分析，这是识别单细胞多位点互作的核心数据特征。

二、测序数据格式

SAM 格式（比对结果存储）

SAM 是存储序列比对信息的标准文本格式，每行代表一条 read 的比对记录，scHi-C 数据中同一 read name 的 R1/R2 记录连续相邻，示例如下：

A01045:956:HMNFYDMXY:2:1101:19307:1016	97	chr10	111308001	60	150M	=	111308051	200	GTATGTGATGGGTCAACGTGCCACAGACTCAGGAGTAACGAGGCCTCCTGACCTCAGACAAAACCTCCAACACTATGAGCACAATGAACGTTCCCTGCTTTTAAAGCTGATGATCTCAGGTATTCTGGTACACTAACAGAAAGCTGATGT	FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFF:FFFFFF:FF	NM:i:1 MD:Z:81A68	MC:Z:150M	AS:i:145	XS:i:0
A01045:956:HMNFYDMXY:2:1101:19307:1016	145	chr10	111308051	60	150M	=	111308001	-200	ACCTCAGACAAAACCTCCAACACTATGAGCAAAATGAACGTTCCCTGCTTTTAAAGCTGATGATCTCAGGTATTCTGGTACACTAACAGAAAGCTGATGTGATGGTTTTAAATGTTAACTCAGAATCATGTGGGAAGAGAGTCTCCATAG	FFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF	NM:i:0 MD:Z:150	MC:Z:150M	AS:i:150	XS:i:0
A01045:956:HMNFYDMXY:2:1101:23683:1047	81	chrX	25068476	0	150M	=	32598360	7529736	TAGATTCCCTCTTTTCTTCCAGATTCCAAGATGCCTTCCAGGCTCGAACCCGGACATGTGAGCCACTGGCCAGCCTCAACAATTTGGCGAACCAATGCAGGACCTGAGAAAGGCAGAGGACATTTGGAAGAAACACTGCTGATTTGTAGC	FFFFF,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFF,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF	NM:i:0 MD:Z:150	MC:Z:150M	AS:i:150	XS:i:150

关键字段原理（scHi-C 核心）

  1. readName：测序原始 read 唯一标识，R1 和 R2 共享完全相同的 read name，是 pairtools 配对的核心依据；
  2. flag：二进制状态码（scHi-C 关键），97/145 为双端 read 正确配对的反向比对标记，81 为单端反向比对标记，直接标识 read 类型与比对方向；
  3. chr/pos：read 比对的染色体与基因组坐标，是染色质互作的定位基础；
  4. mapQ：比对质量值（60为最高可信度，0为无有效比对），parse2 步骤会过滤 min-mapq 40 以下的低质量记录；
  5. CIGAR（150M）：表示 150bp 序列完全匹配，无插入缺失，是 scHi-C 有效比对的标准格式；
  6. RNEXT/PNEXT：配对 read（R1/R2）的比对染色体/坐标，= 表示配对 read 比对在同一条染色体；
  7. SA:Z（嵌合read专属tag）：scHi-C 核心特征，记录一条 read 的多个比对位置，对应染色质多位点空间互作；
  8. NM/MD/AS：比对错配、匹配区域、比对得分等质控标签，用于评估比对可靠性。

原理补充

  1. 双端测序的必要性：Hi-C 实验产生的有效片段均为空间邻近的不同染色质区段连接形成的嵌合片段，R1、R2 分别读取片段两端，可直接定位两个互作位点；
  2. 单细胞数据特征：每个细胞独立生成 R1.fastq.gz 和 R2.fastq.gz 两个文件，保证单细胞分辨率的数据独立性；
  3. 嵌合read价值：scHi-C 中一条 read 可能比对到多个基因组位置，直接对应染色质多位点空间互作。

三、比对流程

BWA 比对（核心比对步骤）

bwa mem -SP5M -T0 -t16 ref.fa R1.fastq.gz R2.fastq.gz > output.int.sam

1. scHi-C 专用参数原理（关键）

-SP5M 是 Hi-C/scHi-C 数据的专用参数组合，专为嵌合read设计，缺一不可：

  • -S：跳过SAM头部校验，适配Hi-C嵌合read的输出格式；
  • -P：严格保留双端read的配对关系，保证R1/R2绑定；
  • -5：仅保留read 5’端比对位置（Hi-C互作仅依赖片段末端坐标，排除内部序列干扰）；
  • -M：将多位置比对的read标记为次级比对，通过SAtag记录所有嵌合位点；
  • -T0：最低比对得分设为0，保留弱比对信号，避免丢失嵌合read；
  • -t16：16线程加速比对。

2. 输出核心规则

BWA 直接输出的 SAM 文件严格按照 read name 排序，同一 read 的 R1、R2 及所有嵌合比对记录连续相邻，这是后续 pairtools 配对的必要前提。

SAM 格式（比对结果存储）

readName  flag  chr7  144581129  60  150M  =  125449562  ...  SA:Z:...
readName  flag  chr7  125449562  60  150M  =  144581129  ...

关键字段原理

  • flag：二进制标记，标识read类型（R1/R2）、比对方向、是否唯一比对；
  • SA:Z:***：嵌合read标记，scHi-C核心特征，记录一条read的所有补充比对位置，对应多位点互作；
  • 坐标信息：记录染色质互作的基因组位置，是三维构象分析的基础。

四、pairtools 处理流程

pairtools 是 Hi-C/scHi-C 数据标准化工具，核心功能是完成read配对、过滤、去重，输出标准化互作对（pairs）。

parse2：SAM → pairs 格式转换（最核心步骤）

pairtools parse2 -c mm10.chrom.sizes --assembly mm10 --add-pair-index --expand --drop-sam --min-mapq 40 input.sam -o output.pairs

工作原理

  1. 算法：采用滑动缓冲窗口扫描SAM，将同名read存入缓冲区，等待R1/R2及嵌合记录全部集齐后完成配对；
  2. 硬性依赖：必须基于read name连续的SAM文件，记录分散则直接判定为无效；
  3. 输出规则：生成pairs格式，存储一对read对应的两个互作位点坐标；
  4. pair_type=UU：两端均唯一比对，是scHi-C有效互作的金标准。

sort：pairs 基因组坐标排序

pairtools sort -o output_sorted.pairs input.pairs

原理

原始pairs按read name排序，相同坐标的重复互作分散存储；按基因组坐标排序后，技术重复会连续排列，为去重做准备。

dedup：PCR 重复去除

pairtools dedup --mark-dups --output-stats output.dedup.stats -o output_dedup.pairs input_sorted.pairs

原理

  1. 重复来源：PCR扩增会导致同一原始嵌合片段被多次测序，产生完全相同的坐标互作（技术噪音）；
  2. 去重逻辑：识别坐标完全一致的pairs，仅保留1条，保证数据的生物学真实性；
  3. --mark-dups：标记重复而非直接删除，便于质控。

select：过滤自连接，保留 UU 有效对

pairtools select '(pair_type=="UU") and ((chrom1!=chrom2) or (abs(pos1-pos2)>10000))' input_dedup.pairs > output.Noselfligation.UU.pairs

原理

  1. 自连接（self-ligation）：Hi-C实验技术噪音，指同一染色质片段自身连接，非真实空间互作；
  2. 过滤规则：同一染色体距离＜10kb的互作判定为自连接，直接剔除；
  3. 保留规则：仅保留UU类型（两端唯一比对）的高可信度互作。

五、自定义过滤流程（R语言，scHi-C特有）

去 blacklist 区域

# 去除两端落入 mm10 blacklist 区域的 pairs
y <- a[a$ID1 == 0 & a$ID2 == 0, ]

原理

黑名单区域是基因组中串联重复、着丝粒、比对异常区的集合，序列重复性极高，互作信号无生物学意义，需彻底剔除。

筛选多位点接触（≥3个10kb bin）

# 只保留一条 PE read 覆盖 ≥3 个唯一 10kb bin 的接触
out <- rec[rec$Num.10Kb.Bin >= 3, ]

原理

  1. scHi-C核心：专注多位点同时互作（Chromatin Hub），区别于普通Hi-C的两位点互作；
  2. 10kb bin：染色质互作的基本分析单元；
  3. 筛选逻辑：≥3个不同bin代表真实多位点互作，＜3个判定为普通Hi-C噪音。

六、典型问题排查：M24样本处理失效分析

6.1 异常症状

  1. M24 样本走完完整流程后，.Noselfligation.UU.pairs 文件几乎为空（仅1行）；
  2. 对照 D0 样本同一步骤有十万级有效互作；
  3. SAM 文件大小（十几GB）、raw pairs 行数均正常，数据未丢失，但全部失效；
  4. 无效pairs特征：全为! 0 ! 0（无基因组坐标）+XX（无效配对类型）。

6.2 根本原因（原理级）

M24 的 BWA 流程错误加入了 samtools 坐标排序：

# 错误流程：排序破坏read name顺序
bwa mem ... | samtools sort -o output.bam - && samtools view -h -o output.sam output.bam
  1. samtools sort 的破坏性：将文件按染色体物理坐标重排，彻底摧毁 BWA 输出的 read name 有序性；
  2. 记录分散：同一read的R1、R2、嵌合比对被随机分散（间隔数百万行）；
  3. pairtools 失效：滑动缓冲窗口无法集齐配对read，全部判定为无效数据；
  4. 输出特征：无效配对统一输出! 0 ! 0 XX，文件大小正常但无有效信息。

6.3 修复方案（仅改一步）

# 正确流程：BWA直接输出SAM，保留read name顺序
bwa mem -SP5M -T0 -t16 ref.fa R1.fastq.gz R2.fastq.gz 2>log > output.int.sam

修复原理

  1. 去掉samtools sort/index，BWA直接输出SAM，严格保留原始read name顺序；
  2. 同一read的R1/R2/嵌合记录连续相邻，满足pairtools parse2的核心要求；
  3. 兼容性：仅修改比对步骤，后续pairtools、R脚本完全无需改动，即可恢复正常输出。

七、流程核心总结

  1. 黄金原则：scHi-C 比对后绝对不能做坐标排序（指的是sam文件不能sort，parse后的pairs文件仍然需要pairtools的sort），必须保留 read name 顺序；
  2. 核心依赖：BWA -SP5M 参数 + 有序SAM + pairtools 滑动窗口配对；
  3. 数据逻辑：嵌合read → 多位点互作 → Chromatin Hub（scHi-C核心生物学信号）；
  4. 失效根源：坐标排序破坏read配对，是scHi-C数据处理最常见的致命错误。